作者單位：519000 中山大學附屬第五醫院
通訊作者：茍新敏
【摘要】 目的 探討中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（NGAL）在食管癌中的表達及其臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法檢測NGAL在50例食管癌和10例正常食管組織中的表達，分析其與病變類型的關系及其在食管癌組的表達率與臨床病理特征的聯系。結果 NGAL在食管癌中顯著表達。結論 NGAL可能在檢測食管癌發生、進展、轉移中具有一定作用。
【關鍵詞】 NGAL； 食管癌； 免疫組織化學
中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是Lipocalin家族的新成員，于1993年在人中性粒細胞中被發現和分離出來 ［1］。近年來，NGAL與人類腫瘤的關系受到了人們的重視，并在NGAL基因的功能以及NGAL在人體正常和腫瘤組織中的表達特征方面取得了一些有意義的進展。本研究采用免疫組織化學方法檢測50例食管癌中NGAL蛋白的表達水平，探討其在食管癌中的表達特點及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 組織標本和一般資料 選取2003～2010年在中山大學附屬第五醫院行初次手術且有完整臨床病理資料存檔的食管癌組織石蠟標本50例（術前均未行化療、放療或生物治療），中位年齡55歲（36～69歲）。腫瘤發生部位：上段12例，中段26例，下段8例，未特指部位4例。病理類型：鱗狀細胞癌28例，腺癌14例，其他類型8例。淋巴結轉移：有轉移 33例，無轉移 17例。正常食管組織10例，以已知乳腺癌陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。所有標本均經HE染色證實診斷。
1.2 主要試劑及檢測方法 鼠抗人NGAL單克隆抗體購于美國R&D公司，免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。采用免疫組織化學二步法，石蠟切片逐級脫蠟至水，抗原修復，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min。PBS沖洗，滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水透明，封片，光鏡觀察。
1.3 結果判定 采用IP（ intensity+percentages）評分方法，綜合考慮染色強度和陽性細胞數，由兩位病理學專家獨立閱片，再討論確定免疫組織化學結果：（1）染色強度計分。細胞漿無染色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。（2）陽性細胞數計分。細胞漿無染色：0分；染色細胞數<1%：1分；染色細胞數1%～10%：2分；染色細胞數10%～33%：3分；染色細胞數33%～66%：4分；染色細胞數>66%：5分。兩項之和即為總分。陰性（-）：<2分；陽性（+～+++）：2～8分；低表達（+）：2～4分；中等表達（++）：5～6分；高表達（+++）：7～8分；以中高等表達記為陽性。
1.4 統計學分析 所有數據采用SPSS 13. 0軟件包處理。樣本率的比較用χ2檢驗及Fisher確切概率檢驗，所有的統計分析均分雙側檢驗。
2 結果
2.1 NGAL在不同性質的食管組織中的表達 通過免疫組化檢測，可見NGAL的表達定位于上皮細胞胞漿中。正常上皮中，只有2例可見NGAL微弱的表達，并且表達位于細胞漿內靠近細胞膜的局限區域，表達率為10%。50例食管癌組織中39例NGAL表達陽性，表達率為78%，多為中、高表達（++～+++）； 食管癌和正常食管組織NGAL的陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 NGAL表達與食管癌臨床病理指標的關系 NGAL蛋白表達與食管癌腫瘤發生部位、病理類型、淋巴結轉移有關。NGAL蛋白在食管上段腫瘤中陽性表達率為83.3%，在食管中段的腫瘤中陽性表達率為76.9%，在食管下段的腫瘤中陽性表達率為75.0%，在未特指部位的腫瘤中陽性表達率為75.0%，差異無統計學意義（P>0.05）。NGAL在鱗狀細胞癌的陽性表達率為82.1%，在腺癌的表達率為79.0%，在其他類型乳腺癌中的表達率為90.9%，各種類型間比較差異無統計學意義（P>0.05）。NGAL蛋白在有淋巴結轉移的食管癌組織中陽性表達率為82.0%，在無淋巴結轉移的食管癌組織中陽性表達率為59.0%，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。
3 討論
Lipocalin是一個有20多種可溶性蛋白組成的大家族。蛋白質晶體結構分析證實，它們均擁有一個高度保守的由8條反向平行的β折疊形成的桶狀親脂性三級結構，其可結合疏水性的小分子形成復合物，也可與某些細胞膜受體結合［2］，在人體內物質轉運、免疫調節等方面發揮著重要作用。NGAL作為Lipocalin家族的一員，其氨基酸序列及DNA內含子和外顯子的排列與本家族其他成員有很高的保守性和同源性。這個獨特的結構讓該家族成員有能力結合一些主要是疏水性的小分子物質而形成復合物，甚至還可以在細胞表面結合特異性受體［2，3］。在親脂性小分子物質的轉運中發揮作用，更在細胞內環境穩定或免疫調節中扮演重要角色。除中性粒細胞外，正常情況下NGAL蛋白亦可微量表達于腔道表面組織細胞，如呼吸系統的肺泡間巨噬細胞、支氣管上皮單個黏液細胞和消化系統的胃壁細胞、小腸部分潘氏細胞、肝膽管細胞、胰小葉內和閏管細胞以及泌尿生殖系統的腎近曲小管細胞、尿道傘部細胞、前列腺上皮細胞等［4］。而在病理狀態下，其表達程度明顯增強。最初學者認為，NGAL可誘導中性粒細胞內顆粒釋放，在抗感染中發揮重要作用［5～7］。最近進一步通過NGAL在大鼠小鼠中的同源基因研究證實，NGAL蛋白在乳腺癌、胰腺癌、肺癌等許多腫瘤中表達上調［4］。研究發現，在HPV E6E7 癌基因轉化基礎上由TPA促成的食管癌細胞系中NGAL mRNA 的表達是明顯升高的，其在永生化人食管上皮細胞癌變中顯著過表達［5］；NGAL可以通過與MMP-9形成復合物，保護并調節MMP-9活性，借助于對MMP-9 、TIMP-1等的調節與惡性細胞的浸潤轉移行為相適應［6］，同時還可能在癌細胞的不良分化中發揮作用［7］，從而認為NGAL可能作為一種新的癌基因，在腫瘤的發生發展過程中具有十分重要的作用。本研究顯示，NGAL蛋白在食管癌中顯著表達，與正常食管組織比較差異具有統計學意義。另外，NGAL在食管癌中的表達與腫瘤的生長部位和臨床病理分型及淋巴結轉移率相關。提示NGAL不僅可以用于腫瘤發生的早期預測，而且在腫瘤的進展、浸潤和轉移中具有一定作用，但其作用機制目前尚未明確。而Bauer等［8］在乳腺癌中發現，NGAL的表達與癌細胞的淋巴結轉移、不良的組織學分級、HER-2/neu過表達以及類固醇激素受體陰性等高度相關。NGAL可以與鐵高親和力結合，介導鐵的轉運，上調鐵易感基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖［9，10］。而Shi等用RT-PCR對鼠的乳腺癌細胞株4T1研究發現，NGAL不能影響癌細胞的增殖，但能明顯促進癌細胞的浸潤與轉移。而在食管癌的研究中發現，反義封閉NGAL基因表達后，接種裸鼠的癌細胞侵襲能力明顯降低［11，12］。Yang等［13］證明，NGAL能夠通過激活ERalpha/Slug信號通路，調節vimentin/fibronectin和E-cadherin的表達及活性，誘導EMT（epithelial tomesenchymal transition）發生，促進乳腺癌細胞侵襲及轉移。
食管癌存在較高的發病率，其與生活方式、飲食習慣等有很大關系，對該病的早期診斷、檢測及干預具有非常重要的意義。本研究證實，NGAL可作為食管癌發生、進展、浸潤及侵襲等發生發展過程中一個重要的檢測指標及靶點，是評估腫瘤生物學特性和預后的一個新的參考指標。在篩選高?；颊?、指導臨床制定合理治療方案等方面具有積極的意義。
參 考 文 獻
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（收稿日期：2011-06-20）
（本文編輯：陳丹云）
