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[摘要] 目的 探討MicroRNA-22-3p（miR-22-3p）在食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）組織中的表達情況，并分析miR-22-3p與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征、預后之間的關系。 方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法（qPCR）檢測miR-22-3p在77例ESCC組織和癌旁正常組織中的表達差異及其與食管鱗狀細胞癌的臨床病理特征、預后的相關性。 結果 miR-22-3p不同程度高表達36.4%（28/77），正常表達20.8%（16/77），低表達42.8%（33/77）。miR-22-3p相對高表達的患者無病生存期較非高表達患者長（P<0.05），但miR-22-3p的表達水平與臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、浸潤程度、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤家族史、吸煙和飲酒）之間均無相關性（P>0.05）。 結論 miR-22-3p在食管癌的發生發展中起著抑癌因子的作用，其高表達能延長食管癌患者的生存時間。
[關鍵詞] miR-22-3p；食管鱗狀細胞癌；無病生存期；抑癌因子
[中圖分類號] R735.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）27-0001-04
腫瘤是發達國家中最主要的死亡原因，在發展中國家位居第二。食管癌的發病率和死亡率在世界范圍內位居第六[1]。鱗狀細胞癌和腺癌是食管癌的主要病理類型，鱗狀細胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分為腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鱗狀細胞癌確診往往已屬晚期，侵襲和轉移的患者預后不佳。目前仍未發現食管鱗狀細胞癌高度特異性標記物，因此早期診斷食管鱗狀細胞癌十分困難[3]。微小RNA（microRNA）是一類22nt左右片段大小的、具有高度組織特異性的非編碼RNA，對確診腫瘤的病理類型和起源具有潛在意義[4]。Real-Time PCR可檢測食管鱗狀細胞癌患者組織中miR-22-3p的相對表達情況，分析miR-22-3p與食管鱗狀細胞癌的病理特征和患者預后之間的關系。本文主要研究miR-22-3p的相對表達情況對食管癌的發生、進展及轉移的作用及預測功能，為食管鱗狀細胞癌的轉移潛能和患者預后評估提供理論依據?，F報道如下。
1資料與方法
1.1一般資料
收集77例ESCC組織及癌旁正常組織，病例來自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手術后組織標本（病理科明確診斷食管鱗癌），女7例，男70例，年齡46～81歲，平均64.4歲。術前未經任何放化療，排除自身免疫性疾病及嚴重感染性疾病。癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5 cm外區域肉眼下正常食管組織；術后標本立即保存于液氮中，并轉移至浙江省腫瘤研究所，提取總RNA，轉錄cDNA后保存于-80℃冰箱待實驗用。組織標本TNM分期和分級：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移33例。本研究經醫院倫理委員會審批同意，電話隨訪患者，隨訪截止時間設定為2013年3月25日。
1.2 試劑
RNA提取試劑盒為Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）反轉錄試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR 081A）real-time PCR試劑盒均購于TaKaRa公司。實驗引物（上海捷瑞）：miR-22-3p：5"-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3"，U6：5"-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 實驗方法
1.3.1 提取總RNA 腫瘤組織及對應正常組織的總RNA按照MirNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取，總RNA的濃度和純度由紫外分光光度計檢測：A260/A 280范圍在1.8～2.1間的樣本用于后續實驗。
1.3.2 轉錄RNA 將上述提取總RNA（1 μg）按說明書提供的反應條件設置溫度，在PCR儀上進行cDNA的逆轉錄。
1.3.3 cDNA擴增 ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems）分析RT-PCR的PCR擴增及溶解曲線。反應體系20 μL，具體操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書步驟。PCR反應過程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，預變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40個循環擴增。PCR溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。設復孔3個取均值計算。按2-△△CT法分析結果：△CT=Ct（miR-22-3p）- Ct（U6）；按△△CT=△CT（癌組織）-△CT（癌旁正常組織）計算miR-22-3p在食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常組織中相對表達情況，表達下降：△△CT>1；表達正常：-1≤△△CT≤1；表達升高：△△CT<-1，設定癌旁正常組織miR-22-3p相對平均表達量為1，其余組表達量為2-△△CT計算，最終計算相對改變倍數。將所有樣本分為高表達組和非高表達組，將臨床病理特征設定為1或者0，并統計各組別例數，χ2檢驗計算兩組別例數是否有統計學差異。電話隨訪計算各例患者的生存時間（月），根據分組情況采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進行單因素生存分析。
1.4 統計學分析
應用SPSS18.0統計軟件，計量資料以（x±s）表示，采用單因素ANOVA比較各組表達倍數；計數資料以率表示，采用χ2檢驗比較各組表達情況和臨床病理特征關系；采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進行單因素生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。
1資料與方法
1.1一般資料
收集77例ESCC組織及癌旁正常組織，病例來自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手術后組織標本（病理科明確診斷食管鱗癌），女7例，男70例，年齡46～81歲，平均64.4歲。術前未經任何放化療，排除自身免疫性疾病及嚴重感染性疾病。癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5 cm外區域肉眼下正常食管組織；術后標本立即保存于液氮中，并轉移至浙江省腫瘤研究所，提取總RNA，轉錄cDNA后保存于-80℃冰箱待實驗用。組織標本TNM分期和分級：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移33例。本研究經醫院倫理委員會審批同意，電話隨訪患者，隨訪截止時間設定為2013年3月25日。
1.2 試劑
RNA提取試劑盒為Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）反轉錄試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR 081A）real-time PCR試劑盒均購于TaKaRa公司。實驗引物（上海捷瑞）：miR-22-3p：5"-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3"，U6：5"-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 實驗方法
1.3.1 提取總RNA 腫瘤組織及對應正常組織的總RNA按照MirNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取，總RNA的濃度和純度由紫外分光光度計檢測：A260/A 280范圍在1.8～2.1間的樣本用于后續實驗。
1.3.2 轉錄RNA 將上述提取總RNA（1 μg）按說明書提供的反應條件設置溫度，在PCR儀上進行cDNA的逆轉錄。
1.3.3 cDNA擴增 ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems）分析RT-PCR的PCR擴增及溶解曲線。反應體系20 μL，具體操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書步驟。PCR反應過程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，預變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40個循環擴增。PCR溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。設復孔3個取均值計算。按2-△△CT法分析結果：△CT=Ct（miR-22-3p）- Ct（U6）；按△△CT=△CT（癌組織）-△CT（癌旁正常組織）計算miR-22-3p在食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常組織中相對表達情況，表達下降：△△CT>1；表達正常：-1≤△△CT≤1；表達升高：△△CT<-1，設定癌旁正常組織miR-22-3p相對平均表達量為1，其余組表達量為2-△△CT計算，最終計算相對改變倍數。將所有樣本分為高表達組和非高表達組，將臨床病理特征設定為1或者0，并統計各組別例數，χ2檢驗計算兩組別例數是否有統計學差異。電話隨訪計算各例患者的生存時間（月），根據分組情況采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進行單因素生存分析。
1.4 統計學分析
應用SPSS18.0統計軟件，計量資料以（x±s）表示，采用單因素ANOVA比較各組表達倍數；計數資料以率表示，采用χ2檢驗比較各組表達情況和臨床病理特征關系；采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進行單因素生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-22-3p相對表達比較
miR-22-3p在食管鱗狀細胞癌組織相對癌旁正常組織高表達28例（36.4%），相對正常表達16例（20.8%），相對低表達33例（42.8%）。設定正常組織miR-22-3p相對平均表達量為1，其中高表達組食管癌的平均表達量為（16.07±5.94），正常組為（0.92±0.36），下降組為（0.13±0.03），高表達組相對表達量與正常組和下降組比較差異有統計學意義（P<0.05）。各組別的樣本相對表達倍數見圖1。
2.2 miR-22-3p相對表達情況與臨床病理特征的關系
miR-22-3p相對表達情況與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系通過χ2檢驗分析：高表達組和非高表達組中miR-22-3p表達水平與臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、淋巴結轉移、浸潤程度、腫瘤家族史、TNM分期、吸煙和飲酒）之間均無顯著相關性（P>0.05），見表1。
2.3 miR-22-3p表達水平與預后的關系
按miR-22-3p相對表達情況將77例食管鱗癌患者分為高表達組和非高表達組，兩組患者的無病生存期采用K-M法分析比較，實驗結果顯示高表達組相較非高表達組更具有生存優勢（r=0.862，P=0.016），見圖2。
3 討論
最近研究[5-8]發現miR-22-3p在前列腺癌中高表達，而在腎細胞癌、乳腺癌、膽管癌和多發性骨髓瘤中低表達，鮮有報道miR-22-3p在食管鱗狀細胞癌中的表達情況和臨床意義。本研究采用實時定量PCR法檢測食管鱗狀細胞癌組織中miR-22-3p相對表達情況，分析研究miR-22-3p的相對表達情況對食管癌的發生、進展及轉移的作用及預測功能，為食管鱗狀細胞癌的轉移潛能和患者預后評估提供理論依據。
本研究檢測了miR-22-3p在食管鱗癌中的表達情況和臨床病理及患者預后的關系，結果表明：在77例食管鱗癌組織標本中，miR-22-3p高表達為28例，正常表達16例，低表達33例。miR-22-3p高表達與臨床病理特征之間無相關性（P>0.05），但部分指標如浸潤程度和淋巴結轉移P值接近0.05，預測 miR-22-3p高表達可能與抑制腫瘤細胞的浸潤和淋巴結轉移存在一定相關性；miR-22-3p高表達的患者生存時間延長，表明miR-22-3p能改善食管鱗癌患者的預后。
本研究證實miR-22-3p在食管鱗癌中高表達患者的預后較非高表達患者好，兩者的差異具有統計學意義，與Zhang等[9]研究miR-22在肝癌中的表達情況和預后等關系結果相一致，同時他們在肝癌細胞中研究還發現miR-22體外抑制肝癌細胞的增殖和轉移，其機制可能與miR-22調控HDAC4基因相關。本研究證實miR-22-3p表達水平與臨床特征如性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結轉移、TNM分期、浸潤程度、吸煙和飲酒無相關性（P>0.05），與Zhang等[10]研究 miR-22的表達在結直腸癌中的臨床意義的結果相一致，miR-22在結直腸癌組織中的表達較正常組織低，miR-22的表達水平和結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學類型、浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤的位置和淋巴管浸潤不相關（P>0.05）；矛盾的是Zhang等研究發現miR-22的表達水平與肝轉移相關（P<0.05），可能與本研究標本量小及標本來源不同有關。
Guo等[11]研究miR-22的表達情況與胃癌關系同樣發現：miR-22可能在胃癌的進展中也發揮著重要的作用。同時在細胞層面研究發現，miR-22可能是通過調控Sp1基因來抑制胃癌細胞的轉移和浸潤。Xu等[12]研究miR-22的表達情況與腫瘤的關系的機制發現：miR-22是一種新型的通過細胞衰老機制調控腫瘤細胞和正常細胞。miR-22在體內外通過促進腫瘤細胞的衰老來阻止腫瘤細胞的進展，miR-22可能主要以SIRT1、Sp1和CDK6基因為靶基因，通過這三個基因的細胞衰老信號通路，最終以p53或pRb通路來抑制腫瘤細胞增殖、浸潤和進展。
Fan等[13]研究發現miR-22在腎細胞癌中低表達，但體外細胞實驗研究發現：miR-22抑制786-0和A498細胞增殖、轉移和浸潤。miR-22可能通過作用于PTEN靶基因發揮抑癌基因的作用。在急性髓系白血病研究中，Jiang等[14]發現miR-22在急性髓系白血病中低表達，且發揮著一個潛在抗腫瘤基因作用。miR-22通過調控多個癌基因（CRTC1、FLT3、MYCBP），抑制CREB和MYC通路發揮作用。miR-22在急性髓系白血病中低表達是由TET1/GFI1/EZH2/SIN3A通路抑制和（或）基因組DNA損失。與此同時，納米粒子攜帶miR-22寡核苷酸在體內顯著抑制白血病進展[15-22]，同時，本文研究揭示TET1/GFI1/EZH2/SIN3A/miR-22/CREB-MYC信號電路，提供了表觀遺傳/遺傳機制，并強調了miR-22在臨床上治療急性髓系白血病的潛力。
本研究結果顯示miR-22-3p是一種抑制食管鱗癌發生、進展的小分子RNA，其相對高表達能延長患者的生存時間，且改善預后。本研究初步證實了miR-22-3p的相對表達情況和食管鱗癌預后的相關性，其高表達可能降低食管鱗癌的浸潤和淋巴結轉移，但細胞機制和分子生物學研究仍需進一步探索。
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（收稿日期：2016-04-27）
